绘制细胞实时调控图谱 打开胚胎发育“暗箱”。
生命伊始，精子和卵子相结合，产生受精卵，细胞开始分裂，生命的画卷自此展开，潜滋暗长形成各种功能完备的组织器官。在此过程中，细胞是如何沿着既定的命运轨道发展的？
为了打开胚胎发育的暗箱，中国科学院遗传与发育生物学研究所（以下简称遗传发育所）杜茁研究组在单细胞水平上绘制了一份蛋白质图谱，它就像一张高精度导航图一样，揭示了胚胎发育过程中细胞实时调控的奥秘。相关成果7月26日发表于《自然—方法学》。
一份了解胚胎发育的分子图谱
生命体的构建始于胚胎发育，其调控高度动态复杂。
发育图式如何建立，即受精卵产生的各个细胞如何获得特定命运，并建成形态功能完备的组织器官，是胚胎发育的核心问题。遗传发育所研究员、文章的通讯作者杜茁对《中国科学报》说。
上世纪70-80年代，发育生物学先驱john sulston通过绘制秀丽线虫全部体细胞的发育起源和谱系关系，首次揭示了一个多细胞动物整个发育过程的细胞图谱，在单细胞水平系统地刻画了发育图式建立过程，线虫也因此成为高精度解析发育动态调控的先导模式动物。
然而，参与发育的细胞的分子特征尚未完全阐明，其内部的分子动态调控过程仍有待深入。
一个切入点是阐明各个细胞在各个时刻的基因表达和调控。长期从事基因时空动态表达与发育调控相关研究的杜茁表示，当前单个细胞的转录组测定已成可能，但如何将转录组与细胞身份精确对应，达成单细胞注释精度仍十分困难。如何进一步提高表达分析的时间精度和维度，实现原位、实时、连续地解析蛋白的动态变化也有待探索。
利用蛋白质融合荧光报告系统和四维实时成像技术，杜茁研究组绘制了一份蛋白质图谱，就像gps实时导航图一样，它包含了线虫胚胎发育期间几乎所有细胞谱系中数百个转录因子的原位动态表达。基于此，研究者在转录因子单细胞蛋白动态表达和命运图式建立调控规律解析方面取得新进展。
动态揭示细胞命运
在胚胎发育过程中，细胞究竟是如何走上不同的命运轨道，发育成不同的器官，或是发挥不同作用呢？
通过聚焦发育调控关键基因——转录因子，杜茁研究组在新研究中构建了数百个可指示蛋白动态表达的荧光报告品系，综合活体成像、细胞鉴定、实时谱系追踪、单细胞荧光定量分析，在原位、4d、单细胞水平解析了转录因子在各个细胞的蛋白动态表达。
作者采用非损伤方式，通过成像和细胞追踪对细胞身份予以精确判定，并系统整合多个蛋白的单细胞表达水平，实现了真正意义单细胞注释精度的蛋白动态表达解析。
这是一篇非常优质的论文，描述了266个转录因子蛋白的表达模式。关键的是，这些基因报告器是由fosmid（质粒克隆）重组或crispr插入内源性位点产生的，绿色荧光蛋白直接与转录因子蛋白融合。一位评价称，这对科学界的相关研究有着巨大价值。
利用该图谱，作者首先从多维度解析了细胞命运图式建立的分子调控框架。研究发现，转录因子在四个层级——谱系来源、体轴定位、细胞类型、发育时间，通过时间和空间上的部分重叠和交错组合，逐步赋予不同细胞各异的调控状态。
每个层次的区分均涉及多个表达部分相似的不同转录因子，赋予调控过程的高度稳固性。文章共同第一作者、杜茁研究组助理研究员马雪华说，计算模拟显示，去除数十个转录因子仅对图式建立的精确度造成有限影响。该结果初步揭示了错综复杂的命运图式逐级建立过程的调控逻辑。
为理解转录因子发育功能，研究整合了单细胞表达相似性和基于实验数据的转录因子-靶基因信息，构建了时空特异性调控回路，涵盖161个发育时空模块中8000多个转录因子间调控关系，并基于此揭示了经典调控基因的新功能和新发育调控过程。
例如，研究发现elt-1/gata3基因除了经典的调控表皮细胞命运之外，同时控制同谱系神经前体细胞的命运，提示elt-1功能的实质为在谱系层级同时调控表皮和神经命运。
研究还揭示了m03d4.4/vezf1在肌肉亚型细胞的趋同分化中的关键功能，体壁和咽喉肌肉细胞不同的上游调控信号汇聚于m03d4.4，通过将之激活并与之协同发挥功能，调控肌肉功能基因从而介导了位于躯体不同部位，具有不同发育起源的同类型细胞的趋同分化过程。因此，高精度 表达启示型 研究范式可高效解析发育调控。
对此，另一位指出，作者之所以能够识别出胚胎发育的调节因子，是因为运用了许多先进的研究方法，该蛋白图谱可进一步与单细胞测序、chip-seq（可在全基因组范围内对蛋白质结合位点进行高效准确筛选与鉴定的方法）、功能实验等相结合。他/她指出，由此获得的单细胞蛋白动态表达图谱还可以被进一步用于推导出可被实验验证的新假说。
引领发育调控新认知
不只是绘制地图，研究者还希望按图索骥，为模拟和解析细胞调控状态与细胞命运的动态关系提供帮助。
基于高时空精度的分子与细胞图谱的整合，研究者系统地探究了细胞调控状态的多样性和复杂性。结果发现调控状态随谱系展开首先呈现出高度差异化，尽管同类组织细胞在随后发生趋同，但仍呈现高度的依赖于谱系来源的状态多样性。
因此，细胞的发育历史对其最终功能的塑造起着不可忽略的影响，而谱系的组织方式决定了同类细胞状态及功能的多样性。论文的共同第一作者，赵志广说。
研究进一步发现，细胞调控状态随发育持续变化，直至终末分裂，其转变轨迹高度非定向，提示沃丁顿发育地貌（遗传学家conrad hal waddington提出的理论，在发育的不同位置存在岔路，导向不同途径）蜿蜒曲折，细胞历经多个中间状态，通过长时间的 绕路 到达终点。
作者表示，该研究为解析胚胎发育的分子调控规律提供了完整、精确和标准化的参考信息，为表达启示型基因发育功能研究、调控状态-功能定量生物学研究、单细胞-全胚胎-多维度系统生物学研究奠定基础。
对于‘高等’模式动物，单细胞分析或为一新兴领域，而线虫发育生物学进入单细胞时代已逾40载。杜茁说，我们的研究提示，即便是仅由千余个细胞构成的 ‘简单’生物，对其发育调控动态性、多样性和复杂性的认知才刚刚开始。
新研究在这一方面无疑具有引领性。正如其中一位所说：这项研究提供了非常有价值的资源并展示了其效用，不仅对胚胎研究者，在其他生物过程研究中，对转录因子相互作用感兴趣的人也一样。
杜茁研究组马雪华、赵志广和肖龙为本论文的共同第一作者，徐伟娜、寇雅慧、王洋洋和北京生命科学研究所董梦秋实验室的张艳苹、吴刚参与了部分工作。本研究得到中国科学院战略性先导科技专项 (b类)、国家自然科学基金和分子发育生物学国家重点实验室资助。（来源：中国科学报冯丽妃）
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41592-021-01216-1
转录因子单细胞蛋白表达动态图谱揭示发育命运图式建立的分子调控基本框架 马雪华等
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作者：杜茁等 来源：《自然—方法学》
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