南京林大实现光热电纺纳米纤维胞内递送及其在细胞免疫治疗的应用。 北京时间2021年10月21日晚23时，南京林业大学黄超伯教授、熊燃华教授联合比利时根特大学stefaan c. de smedt院士和kevin braeckmans教授在 nanotechnology上在线发表了一篇题为photothermal nanofibers enable safe engineering of therapeutic cells的研究型论文。
他们开发了一种新型的生物大分子胞内递送方法，其不仅保持了光敏纳米粒在光响应胞内递送的主要优点，同时避免了其致命缺点，即光敏纳米粒残留在细胞内产生潜在的毒副作用。通过优化光敏纳米粒在纳米纤维的嵌合度，以控制作用于细胞的光热效应，创造性地将光响应纳米粒胞内递送与静电纺丝技术相结合，实现了纳米粒与细胞非接触的生物大分子药物安全高效的胞内递送，增强生物大分子药物药效，有望进一步提高疾病治疗效果。
中比先进生物医用材料国际联合实验室（南京林业大学-根特大学）熊燃华教授为该论文的第一作者和通讯作者，黄超伯教授、stefaan c. de smedt院士和kevin braeckmans教授为共同通讯作者。
光响应纳米粒胞内递送技术的递送效率依赖于光敏纳米粒与细胞紧密黏附，其潜在的毒副作用阻碍了该方法进一步向临床应用快速转化。例如，在脉冲光作用下，光敏纳米粒碎裂成只有几纳米的粒子残留在细胞内，可能导致细胞意外的基因突变。在细胞治疗中，这一问题尤其值得关注，因为治疗细胞的基因突变可能导致意外的毒副作用。因此，亟需构建一种新的生物医用光响应材料，以避免细胞与光敏纳米粒直接接触，但同时又不妨碍光敏纳米粒产生的光热效应增强细胞膜通透性，实现光敏纳米粒与细胞非接触的生物药物安全、高效的胞内递送。
图1：研究成果设计图。
针对上述难点，研究团队在生物医用光响应纳米纤维的构建及其生物大分子药物胞内递送的应用开展了基础、系统、深入的研究（如图1和图2a）。主要研究内容包括：（1）研究了光敏纳米粒嵌合的纳米纤维结构与胞内递送效率的构效关系；重点关注静电纺丝制备参数，控制嵌合光敏纳米粒与纤维表面接触的细胞距离，以保证嵌合光敏纳米粒生成的光热效应能有效增强细胞膜通透性，得到最优光响应纳米纤维结构，用于生物大分子药物胞内递送；（2）进一步，研究了光响应纳米粒生成的光热效应与细胞膜作用机理；主要关注光辐照光敏纳米粒生成光热效应的过程，及其作用于细胞膜增强细胞膜渗透性的机制；（3）应用小鼠模型，采用最优光响应纳米纤维递送生物高分子药物小干扰核酸到人体免疫t细胞内，以形抑制pd-1蛋白的表达，从而提供治疗t细胞（car-t细胞）抑制肿瘤增长，最终达到增强治疗效果的目的。主要实验原理如下：如图2a左上图所示，在光辐照前，细胞黏附在光敏纳米粒嵌合的纳米纤维上；当光辐照纳米纤维负载的光敏纳米粒，激发光敏纳米粒产生光热效应作用于细胞膜（图2a左中图）；合理的纳米粒嵌合度保证了光热效应能有效作用于细胞膜，增强其通透性，但又不与细胞直接紧密接触（图2a右上图）；分散在胞外的生物大分子药物通过局部通透的细胞膜扩散进入胞内，实现安全高效生物大分子药物胞内递送（图2a左下图）；主要取得如下研究成果。
1 光热纳米纤维的制备与表征。
光热纳米纤维由聚合物（pcl）和氧化铁纳米粒（ionp）的混合物电纺制备而得。扫描电子显微镜（sem）和透射电子显微镜（tem）结果显示：在不同纳米粒的浓度，纳米纤维的平均直径约为300 nm（图2b-d）。通过共聚焦显微镜观察发现，静电纺丝1 h后，纤维膜的厚度逐渐增加到4µm（图2e,f）。当添加ionps时，纤维膜的厚度没有明显变化（图2g）。当ionp含量从0.02%增加到5%时，氧化铁纳米粒面积密度从1.7团簇/1000µm²线性增加到192团簇/1000µm²（图2i）。进一步，通过定义三个参量，分析了ionps在纳米纤维中的分布情况（图2j-m）。
图2：光热纳米纤维胞内递送概念及光热纳米纤维的表征。(a)光热纳米纤维的胞内递送原理示意图。(b)含有0和1 wt%光响应纳米粒的纳米纤维的sem和tem图像。(c)不含纳米粒的纳米纤维直径分布图。(d)含不同纳米粒(0 - 5%)的纳米纤维直径。(e)纳米纤维(不含纳米粒)的共聚焦显微镜图像。(f)纤维膜厚度随着静电纺丝时间的变化。(g)30 min纺丝后，纳米纤维膜厚度与含纳米粒的关系。(h)20 kv的sem成像清楚地显示了纳米粒在纤维内部(下)，而在1.5 kv较低电压下则不是这样。(i)单位面积的纳米粒团簇与纳米粒含量的关系。(j-m)纳米粒在纳米纤维中的分布示意图以及相应结果。
2 光热纳米纤维高效、安全的大分子胞内传递。
首先，光热纳米纤维被证明能高效、安全递送大分子到hela贴壁细胞。通过共聚焦显微镜图像结果定量分析，得到增加激光能量密度或纳米粒的含量能提高递送效率，但细胞毒性也逐渐增加；发现当激光能量密度为0.08 j/cm2和纳米粒含量为1%时，得到最优胞内递送结果（图3a）。接下来，测试了光热纳米纤维对jurkat悬浮细胞的递送效率。发现当激光能量密度为0.16 j/cm2和纳米粒含量为2%时，得到最优胞内递送结果（图3b）。最后，质谱检测结果表明包裹在纳米纤维中的纳米粒没有泄露到溶液或细胞（图3c-f）。
图3：光热纳米纤维高效、安全的大分子胞内传递。(a)红色荧光标记的10 kda葡聚糖（rd10）的hela贴壁细胞递送效率、存活率与激光能量密度、光敏纳米粒含量的关系。(b)jurkat悬浮细胞递送效率、存活率与激光能量密度、光敏纳米粒含量的关系。(c-d)光照射后icp-ms/ms测定细胞中fe含量的实验示意图；不同实验条件下，fe含量的测量结果。(e-f)光照射后icp-ms/ms测定水溶液中fe含量的实验步骤示意图，以及不同实验条件下的fe含量的测量结果。
3 局部瞬态热效应是光热纳米纤维增强细胞膜通透性的主要原因。
实验结果证明了光化学反应如活性氧（ros）的产生不是增强细胞膜通透性的主因，因为该项研究中使用的脉冲宽度（7 ns）不太可能引起光化学反应使得细胞膜通透性增强（一般，光化学反应采用超快飞秒脉冲激光与光敏纳米粒作用产生）。这也意味着光热机制是导致细胞膜通透性的主要原因。而光热机制通常有两种形式：纳米气泡造成的局部细胞膜穿孔，或者通过热传递导致细胞膜通透性增强。实验结果表明：纳米气泡生成需要当前采用最高的激光能量密度的数十倍之高，因此也可以排除纳米气泡造成细胞膜穿孔作为主要机制。通过上述排除法，证实了热传递是细胞膜通透性增强的主要机制。其过程是纳米纤维内的光敏纳米粒簇在脉冲光作用下，局部温度迅速升高，使得细胞与纳米纤维接触的局部细胞膜通透性增强（图4a）。最后，理论数值模拟了脉冲激光照射光敏纳米粒后的热传递过程以及主要影响参数（图4b-j）。
图4：局部瞬态热效应是光热纳米纤维致细胞膜通透的主要原因。(a)激光诱导光热纳米纤维产生热效应及热传递示意图。(b)采用紫外-可见光谱法测量得到160 nm光敏纳米粒的消光光谱以及根据mie理论计算结果。(c)光敏纳米粒在647 nm吸收7 ns脉冲激光温度升高的计算结果。(d)0.08 j/cm2激光能量密度照射下诱导光热纳米纤维产生热效应及其热传递的结果。(e-f)平均温度和有效热效应面积随着时间的变化。(g-j)平均温度和有效热效应面积在不同纳米粒聚合情况随着激光能量密度的变化。
4 光热纳米纤维应用于生物大分子sirna或crispr/cas9的胞内递送研究。
成功实现模型大分子胞内递送后，光热纳米纤维进一步被应用于生物功能大分子sirna或crispr/cas9的胞内递送。首先，光热纳米纤维将抗绿色荧光蛋白（gfp）的sirna递送到稳定表达gfp的h1299细胞中。研究结果表明随着sirna浓度（0.5，1，2和5µm）的增加，gfp的静默效率越高，同时不影响细胞活性（图5a-f）。接着，光热纳米纤维将敲除gfp表达的rnps递送到h1299细胞中。研究结果表明gfp的敲除效率随着rnp浓度的增加而增加，最高rnp浓度的gfp敲除效率可达80%（图5g-j）。
图5：光热纳米纤维应用于生物大分子sirna或crispr/cas9rnps的胞内递送研究。(a)光热纳米纤维将sirna或rnps递送到h1299细胞以抑制或敲除绿色荧光蛋白（gfp）表达的实验示意图。(b)共聚焦显微镜图像显示了对照和sirna胞内递送的h1299细胞gfp的表达。(c)相应的流式细胞仪直方图结果。(d-f)24小时后h1299细胞在不同情况下的gfp表达和活性结果。(g-h)光热纳米纤维将rnps递送到h1299细胞以敲除gfp表达；共聚焦显微镜图像和相应的流式细胞仪结果。(i-j)48小时后h1299细胞在不同情况下的gfp敲除和活性结果。
5 光热纳米纤维应用于人胚胎干细胞(hesc)高效安全的生物大分子胞内递送。
在该工作中，光热纳米纤维还被应用于细胞治疗相关的人胚胎干细胞（hescs）的胞内递送。实验结果表明随着递送效率逐渐提高，但同时细胞活性也降低了；当i=0.08 j/cm2时，获得最优递送效率为63%；与此相比，传统电穿孔方法在最优程序（ce-118）的递送率仅为25%（图6a-d）。同时，研究结果表明光热纳米纤维处理后的人胚胎干细胞不影响干细胞功能特性（图6e-i）。最后，光热纳米纤维成功的应用到递送rnps到hescs细胞，以敲除x染色体上的il-2rgamma（il-2r）基因表达（图6j-k）。
图6：光热纳米纤维应用于人胚胎干细胞（hesc）高效安全的生物大分子胞内递送。(a)不同实验条件下，hesc胞内递送效率和细胞活性。(b)不同电穿孔条件下的hesc递送效率和细胞活性。(c)共聚焦显微镜图像显示了hesc递送效率和细胞活性。(d)在最优光热纳米纤维和电穿孔实验条件下处理hesc后，24 h后两者细胞存活率和递送效率。(e)最优实验条件下处理hesc后，细胞生长效率。(f)光热纳米纤维处理hescs24小时后，转录因子oct4 (pou5f1)、sox2和nanog免疫染色共聚焦显微镜图像。(g)oct4 (pou5f1)、sox2和nanog转录因子的量化结果。(h)标记特异蛋白tnnt2和nkx2.5的免疫染色共聚焦图像展示了hescs分化为心肌细胞。(i)心肌细胞tnnt2和nkx2.5的量化结果。(j)hescs在不同实验情况下的sanger基因序列。(k)通过sanger测序分析了il-2r敲除效率。
6 光热纳米纤维应用于人t细胞高效安全的生物大分子胞内递送。
最后，光热纳米纤维被应用于人供体来源的t细胞的胞内递送。研究发现光热纳米纤维的最佳递送效率为40.7%，而传统电穿孔方法为19.3%，尽管在递送sirna以抗pd-1蛋白表达效率类似（图7a-d）。为保证递送安全性，递送方法应该最小限度地干扰治疗细胞的功能特性。结果表明光热纳米纤维对t细胞形态、表型、激活状态的功能没有显著影响，而以此相反的是电穿孔对t细胞功能影响较大（图7e-f）。最终导致了电穿孔处理的t细胞在目标细胞杀伤功能减弱，而光热纳米纤维处理的t细胞能保持原有功能特性（图7i-j，图8）。
图7：光热纳米纤维应用于人t细胞高效安全的生物大分子胞内递送。(a)光热纳米纤维应用于t细胞递送。(b)电穿孔后的t细胞递送。(c-d)光热纳米纤维和电穿孔方法递送小干扰核酸sipd1到t细胞以抑制pd1蛋白表达。(e)光热纳米纤维和电穿孔方法处理t细胞1小时后，对细胞尺寸的影响。(f)光热纳米纤维和电穿孔方法处理t细胞后，相对钙离子随时间的变化。(g)光热纳米纤维和电穿孔方法处理t细胞后，几种关键促炎或抗炎细胞因子的分泌情况。(h)光热纳米纤维和电穿孔方法处理t细胞后，激活标记物cd137、cd154以及pd1的蛋白表达情况。(i)光热纳米纤维和电穿孔方法处理t细胞后，细胞的增殖情况。(j)光热纳米纤维和电穿孔方法处理t细胞后，细胞在体外对目标细胞杀伤情况。
图8：光热纳米纤维处理后的t细胞在体内保持着细胞功能特性。(a)光热纳米纤维将sirna递送到car-t细胞以证明在skov3肿瘤小鼠模型有效性的实验示意图。(b)静脉注射car-t细胞（阴性对照，n=5）、光热纳米纤维将sipd1递送到car-t细胞（实验组，n=4）、car-t细胞联合pd1-抗体给药（阳性对照，n=4）的肿瘤大小随时间变化。
总之，该工作开发了一种新型的生物大分子胞内递送方法，其不仅保持了光敏纳米粒在光响应胞内递送的主要优点，同时避免了其致命缺点，即光敏纳米粒残留在细胞内产生潜在的毒副作用。通过优化光敏纳米粒在纳米纤维的嵌合度，以控制作用于细胞的光热效应，创造性地将光响应纳米粒胞内递送与静电纺丝技术相结合，实现了纳米粒与细胞非接触的生物大分子药物安全高效的胞内递送，增强生物大分子药物药效，有望进一步提高疾病治疗效果。
该成果得到了国家自然科学基金项目、南京林业大学标志性成果培育项目等资助。（来源：科学网）
相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41565-021-00976-3
作者：黄超伯等 来源：《自然-纳米技术》
下一篇：