这是首次提出并证实circrna是作为mirna的海绵起调控作用，自此circrna相关研究快速增长，逐渐成为非编码rna领域最火热的明星分子。
1.mirna分子海绵，circrna含有大量的mirna结合位点，具有mirna海绵作用，进而间接调控mirna下游靶基因的表达。
2.调控基因转录，circrna也可以通过与rna结合蛋白的结合来调控蛋白功能，比如通过与转录因子的结合来抑制基因的转录。
3.编码功能，circrna虽然属于非编码rna，但是也有部分circrna可以编码多肽，通过该多肽行使调控功能。
结肠直肠癌(crc)是全球第三大最常见的恶性疾病，也是导致癌症相关死亡的第四大原因。因此，发现用于预后预测的新潜在生物标志物并深入阐明crc恶性肿瘤的确切分子机制可能改善crc患者的治疗。
circrna与人类疾病尤其是癌症密切相关，由于其丰富性和稳定性，它们可能成为更好的生物标志物。 circhipk3是一种特别丰富的circrna，已被证实参与代谢失调和肿瘤发生。
c-myb作为转录因子，促进circhipk3的表达，吸附mir-7，从而降低mir-7对癌基因的抑制作用，进而促进结直肠癌的发展和转移。
1、circhipk3在crc中有明显的表达上调，而circhipk3表达的增加预示着预后不良。
接下来，我们研究了circhipk3在crc细胞系和组织中的表达水平。 与正常结肠粘膜上皮细胞(fhc)相比，circhipk3在crc细胞系(hct116，ht29，sw480，sw620，dld1)中的表达显著上调(图4)。
通过分析kaplan-meier生存曲线(p <0.001)，circhipk3高表达的crc患者的总体存活显著低于circhipk3低表达的患者(图5左)。进一步的cox多因素生存分析显示，circhipk3的高表达是crc患者生存差的独立预后因素(图5右)。这些结果表明circhipk3上调作为crc发展的早期事件并且在crc进展中具有重要作用。
之前有研究显示在糖尿病患者中c-myb促进circhipk3的转录而使其富集。我们发现c-myb在crc细胞系(图6a)和组织(tcga数据库)(图6b)中显著过表达，这与以前的研究一致。
在hct116和ht29细胞系中使用sirna敲低c-myb的表达，circhipk3表达显著降低;过表达c-myb，则circhipk3表达显著增加(图7a)。荧光素酶报告基因检测显示c-myb过表达显着增强了circhipk3启动子中含有c-myb位点的载体的荧光素酶活性，而突变型c-myb结合位点的荧光素酶活性未受影响(图7b)。以及chip实验，进一步表明c-myb通过直接结合circhipk3启动子区域来增加circhipk3的表达。
为了研究circhipk3在crc中的生物学功能，使用sirna针对circhipk3的连接位点以沉默hct116和ht29细胞系中的circhipk3表达。这些sirna显著降低circhipk3表达水平，但对其线性异构体没有影响(图8a)。克隆形成实验显示circhipk3敲低显著抑制hct116和ht29细胞系的克隆形成能力(图8b)。通过cck8实验(图8c)和edu测定(图8d)测量细胞增殖，显示沉默circhipk3会显著抑制这两种细胞系中的细胞增殖。
si-circhipk3组中，存在更多的凋亡细胞(图9e)。 circhipk3沉默显著阻碍hct116和ht29细胞迁移(图9f)和侵袭(图9g)。这些数据共同表明circhipk3的沉默可以延缓crc细胞的进展。
利用生物素标记的mir-7及其突变模拟物在过表达circhipk3的hct116和ht29细胞中pull down circhipk3，结果显示野生型mir-7捕获更多circhipk3 (图11d)。萤光素酶报告基因检测证明mir-7的过表达显著降低含有完整circhipk3序列的荧光素酶活性，但不影响hct116和ht29细胞中具有突变型mir-7结合位点的萤光素酶活性(图11e)。fish实验结果显示circhipk3和mir-7共定位在细胞质中(图11f)。
mir-7是一种众所周知的肿瘤抑制因子，参与许多人类肿瘤的发展和进展。mir-7的过表达显著抑制了crc细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡(图13)。circhipk3质粒和mir-7模拟物共转染的crc细胞比仅用mir-7模拟物转染crc细胞出现更多克隆(图13a)。 与单独的mir-7过表达相比，过表达mir-7与circhipk3一起促进crc细胞增殖(图13b)。 mir7 circhipk3组与单独mir7组相比凋亡细胞较少(图13c)。 与单独mir-7过表达相比，mir-7和circhipk3过表达阻碍hct116和ht29细胞迁移(图13d)和侵袭(图13e)。 与mir-7过表达或circhipk3沉默相比，mir-7的过度表达与circhipk3的敲低相结合显示出对crc细胞恶性表型更强的抑制作用。
为证实circhipk3是否通过提高mir-7靶标的癌基因的的表达来发挥促肿瘤作用，选择一组与生长和转移相关的mir-7靶基因做qrt-pcr分析，结果显示circhipk3的过表达会增加fak，igf1r，egfr和yy1的表达，circhipk3的敲低会降低fak，igf1r，egfr和yy1的表达(图14f)。与仅用mir-7模拟物转染的细胞相比，在用mir-7模拟物和circhipk3载体共转染的crc细胞(hct116和ht29)中fak，igf1r，egfr和yy1的表达显着增加(图14g)。上述结果表明circhipk3的过表达通过提高mir-7并随后促进fak，igf1r，egfr和yy1表达，从而有效地逆转了mir-7造成的crc细胞侵袭性减弱。
为了进一步评估circhipk3是否在体内发挥肿瘤促进作用，通过皮下注射等量的hct116细胞(每组n = 8)建立了异种移植小鼠模型。约10天后，当肿瘤体积达到约100mm³时，单独si-circhipk3，单独agomir-7或两者联合，均每两天瘤内注射连续两周时间。agomir-7或sicirchipk3的肿瘤内注射分别显着降低肿瘤体积和重量。更重要的是，联合sicirchipk3和agomir-7组比si-circhipk3或agomir-7单独显示更小的肿瘤体积和重量(图15a)。同样，在mrna和蛋白水平，mir-7过表达或circhipk3敲低均显著降低mir-7靶向的原癌基因(fak，igf1r，egfr，yy1)的表达，并且联合组表现出这些癌基因的较低表达。分析还显示与si-circhipk3或agomir-7组相比，si-circhipk3 agomir-7组中ki67，mmp9阳性细胞和微血管密度降低以及半胱天冬酶-3阳性细胞增加(图15b)。
通过尾静脉注射hct116细胞到裸鼠中建立了转移模型(每组n = 8)。在对照组中观察到平均每只小鼠38个肺转移性结节，在agomir-7或si-circhipk3组中分别观察到17和19个，而在联合si-circhipk3和 agomir-7组仅有6个转移(图15c)。这些数据表明circhipk3的沉默会抑制crc生长和体内转移，并且与mir-7过度表达结合显示出对肿瘤抑制的累加效应。
这篇circrna研究文章，做的是经典的mirna海绵作用的研究思路，而且用了明星分子mir7，依然发了6分的文章。不过不得不说，文章的工作量比较大，做了很多实验，而且整体思路非常严谨。
上一篇：
下一篇：