中国疾病预防控制中心在新英格兰医学杂志报道武汉新型冠状病毒研究情况
a novel coronavirus from patients with pneumonia in china, 2019
写在前面
本论文是中国疾病预防控制中心、首都医科大学、湖北省疾病预防控制中心、中国科学院、山东医学科学院于2020年1月24日联合发表在新英格兰医学杂志上，通讯作者为中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒病应急技术中心主任谭文杰、中国疾病预防控制中心主任高福、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所党委书记武桂珍。
摘要
2019年12月，一群不明原因的肺炎患者被发现与中国武汉的海鲜批发市场有关。通过对肺炎患者样本进行无偏测序，发现了一个以前未知的β冠状病毒。从人类气道上皮细胞分离获得一种命名为2019-ncov的新型冠状病毒，该冠状病毒在sarbecovirus亚属orthocoronavirinae亚科内形成了另一个进化分枝。不同于mers-cov和sars-cov，2019-ncov是能感染人类的冠状病毒家族的第七个成员。目前正在进行增强监控和进一步调查。
前言
新发和再现病原是公共卫生的全球挑战。冠状病毒是一种包膜的rna病毒，广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类中，并引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。目前已知六种冠状病毒可引起人类疾病。四种病毒—229e，oc43 ，nl63和hku1是普遍的，在具有免疫能力的个体中通常引起普通的感冒症状。其他两种病毒—严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)和中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)起源于人畜共患病，有时会引发致命的疾病。sars-cov是2002年和2003年在中国广东导致严重急性呼吸道综合症暴发的病原体。mers-cov是造成2012年中东爆发严重呼吸道疾病的病原体。鉴于冠状病毒的高度流行性和广泛分布性、其基因的多样性和基因组的频繁重组以及不断增加的人类与动物的交互行为，由于频繁的跨物种感染和偶然的外溢事件导致的新型冠状病毒很可能会在人类中周期性地出现。
2019年12月下旬，中国湖北省武汉市几家当地卫生机构报告了一群不明原因的肺炎病人，流行病学表明与当地的海鲜批发市场有关。2019年12月31日，中国疾病预防控制中心派出了一个快速应急小组，协同湖北省和武汉市卫生部门开展流行病学和病因学调查。 在此我们报告了这项调查的结果，确定了肺炎聚集的来源，并描述了由中国疾病预防控制中心从疾病爆发早期肺炎患者样本中检测到的一种新型冠状病毒。此外我们还描述了其中两名患者的肺炎的临床特征。
结果
1. 病人情况描述
三名患有严重肺炎的成年患者于2019年12月27日进入武汉的一家医院。患者1为49岁女性，患者2为61岁男性，患者3为32岁男性。患者1和2可获得临床资料。2019年12月23日患者1报告无基础慢性疾病，但报告有发烧(温度37°c至38°c)和咳嗽伴胸部不适。发病四天后，患者1咳嗽和胸部不适加剧，但发烧减少;基于计算机断层扫描(ct)扫描做出肺炎的诊断。患者1的职业是海鲜批发市场的零售商。患者2最初于2019年12月20日报告发烧和咳嗽;发病后7天出现呼吸窘迫，并在接下来的2天内恶化(见胸部x线片，图1)，此时开始进行机械通气。患者2是海鲜批发市场的常客。患者1和患者3已康复，并于2020年1月16日出院。患者2于2020年1月9日死亡。未获得活检标本。
图1. 胸片
2. 新型冠状病毒的检测和分离
2019年12月30日，从武汉金银潭医院收集了3份支气管肺泡灌洗液样本。使用respifindersmart-22kit在这些患者的临床标本中未检测到特异性病原体(包括hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43和hcov-hku1)。从患者的支气管肺泡灌洗液中提取rna作为模板，利用illumina和纳米孔测序对基因组进行克隆和测序。从单个样本中获得了超过20,000个病毒测序片段，并且大多数重叠群与beta冠状病毒属b分支的基因组相匹配—其中与之前发表的蝙蝠sars样冠状病毒(bat-sl-covzc45，mg772933.1)的全基因组一致性超过85%。使用实时rt-pcr靶向测定泛β-cov的共有rdrp区也获得了阳性的结果(尽管对于检测到的样品来说其循环数高于34)。利用人气道上皮细胞以及vero e6和huh-7细胞系从临床标本中分离获得病毒毒株。分离得到的病毒命名为2019-ncov。
为了确定是否可以在2019-ncov感染的人气道上皮细胞中看到病毒颗粒，每天用光学显微镜检查空白感染和2019-ncov感染的人气道上皮培养物，并于接种后第6天通过透射电子显微镜观察。 感染96小时后在人气道上皮细胞的表面层观察到细胞病变作用。利用光学显微镜在焦点中心可以观察到纤毛跳动缺乏(图2)。直到接种后6天，在vero e6和huh-7细胞系中都没有观察到特异性的细胞病变作用。
图2. 人气道上皮细胞接种2019-ncov后的细胞培养图片
电镜下观察2019-ncov阴性粒子一般呈球形，但有些呈多边形(见图3)。直径在60 - 140 nm之间。病毒颗粒有明显的棘突，大约9 - 12 nm, 导致病毒呈现了日冕状。在人气道上皮超薄切片中可以发现胞外游离的病毒颗粒和胞质膜泡内充满病毒颗粒的包涵体。这些观察到的形态与冠状病毒科相一致。
图3. 2019-ncov在透射电子显微镜下图片
为了进一步确定病毒特征，对患者临床样本(肺泡灌洗液)和人类呼吸道上皮细胞分离到的病毒用illumina和nanopore 平台进行了测序分析。从这3位患者体内都鉴定到了新型冠状病毒。从肺泡灌洗液中获得了2个接近全长的冠状病毒序列(betacov/wuhan/ivdc- hb-04/2020, betacov/wuhan/ivdc-hb-05/2020|epi_isl_402121)，从一位患者体内分离到的病毒得到了全长基因组序列(betacov/wuhan/ivdc-hb-01/2020|epi_isl_402119)。这3个新型冠状病毒全基因组序列已经提交到gasaid(betacov/wuhan/ivdc-hb-01/2019, accession id: epi_isl_402119; betacov/wuhan/ivdc-hb-04/2020, accession id: epi_isl_402120; betacov/wuhan/ivdc-hb-05/2019, accession id: epi_isl_402121)。与之前报道过的蝙蝠体内分离到的sars样冠状病毒(bat-sl-covzc45, mg772933.1)有86.9%的核酸序列一致性。这3个新型冠状病毒基因组聚类在一起，形成了sarbecovirus亚属内的一个独立分枝。这些基因组具有典型的beta冠状病毒属结构：一个5′非翻译区(utr)、复制酶复合物(orf1ab)、s基因、e基因、m基因、n基因、3′utr和几个未定义的非结构蛋白开放读码框。
尽管2019-ncov与在蝙蝠中检测到的某些β-冠状病毒相似(图4)，但它与sars-cov和mers-cov不同。 来自武汉的三种2019-ncov冠状病毒与两种蝙蝠衍生的sars样毒株zc45和zxc21共同构成了sarbecovirus亚种b系。 来自人类的sars-cov病毒株和从中国西南地区收集的蝙蝠的sars样冠状病毒形成了sarbecovirus亚属内的另一个进化枝。 由于在2019-ncov和beta冠状病毒的其他成员之间保守复制酶结构域(orf 1ab)中的序列一致性小于90%，因此作为武汉病毒性肺炎的可能病原体2019-ncov是一种属于冠状病毒科sarbecovirus亚属的新型beta冠状病毒。
图4.2019-ncov和正冠状病毒亚科中其他乙型冠状病毒基因系统发育树分析图
讨论
我们报告了一种新的冠状病毒(2019-ncov)，该病毒已于2019年12月和2020年1月在中国武汉的住院患者中被鉴定出。该病毒的存在证据包括通过全基因组测序在三名患者的支气管肺泡灌洗液中进行鉴定，直接pcr和培养。该冠状病毒可能引起的疾病被称为“新型冠状病毒感染的肺炎”(ncip)。完整的基因组已提交给gasaid。系统发育分析表明，2019-ncov属于beta冠状病毒属，其中包括在人，蝙蝠和其他野生动物中发现的冠状病毒(sars-cov、蝙蝠sars状cov等)。我们报道了病毒的分离以及对其特定细胞病变效应和形态的初步描述。
多年来分子生物学技术已成功用于鉴定传染原。无偏倚的高通量测序是发现病原体的有力工具。下一代测序和生物信息学正在改变我们应对传染病暴发的方式，加深了我们对疾病发生和传播的理解，加速了对病原体的识别并促进了数据共享。我们在本报告中描述了利用分子技术和无偏倚dna测序来发现导致在中国武汉的三名患者中引起严重肺炎的一种新型的β冠状病毒。
尽管建立人呼吸道上皮细胞培养物是劳动密集型的，但它们似乎是分析人呼吸道病原体的有价值的研究工具。我们的研究表明，通过呼吸道分泌物最初在人气道上皮细胞培养物上增殖，然后用透射电子显微镜和对培养上清进行全基因组测序，成功地用于观察和检测新的人冠状病毒，而这可能是传统方法无法做到的。
我们还需要进一步建立可准确、快速鉴别呼吸道未知病原体的方法。基于在此研究中得到的3条完整基因组，我们设计了几个针对2019-ncov基因组的orf1ab、n和e基因区域的特异且敏感的分析方法，可以检测出临床样本中的病毒rna。引物序列和标准操作程序已与世界卫生组织共享，用于在全球和中国监测和检测2019-ncov感染。最新的数据显示，中国已有830人检测出2019-ncov。
虽然我们的研究没有完全遵循科赫法则，但我们的分析提供了2019-ncov在武汉暴发的证据。我们还需提供有关2019-ncov引起武汉疫情的其他证据，包括在患者的肺组织中用免疫组化方法检测到2019-ncov抗原，从同一患者两个时间点的血清标本中检测出可证实血清转化的抗病毒igm和igg抗体，以及来自动物(猴子)实验的致病性证据。至关重要的是进行流行病学调查，以确定感染的传播方式、繁殖间隔期和感染的临床症状谱，从而为制定预防、控制和制止2019-ncov传播的战略提供指导。
reference: zhu na, zhang dingyu, wang wenling, et al. a novel coronavirus from patients with pneumonia in china, 2019.nejm,january 24, 2020 doi: 10.1056/nejmoa2001017
撰文：李杰 常熟理工学院生物与食品工程学院
责编：刘永鑫 中科院遗传发育所
